精确控制基因表达强度和动态模式对于代谢工程和合成生物学非常重要，特别是对于精细调控代谢途径和优化基因回路。目前研究已经建立了一系列用于调控基因表达的基因调控元件，包括启动子、终止子、核糖体结合位点序列、sRNA和蛋白降解标签等。除了这些调控元件外，基因N端编码序列（N-terminal coding sequence，NCS）通过影响核糖体在翻译起始阶段与mRNA结合和延伸的效率，在翻译水平上强烈影响基因表达，是细菌中的基因表达水平调控的重要机制。然而，目前缺乏实验表征的NCS文库和合理的设计方法，这限制了NCS在精细调控代谢途径上的应用。因此，使用工程化的NCS工具在代谢工程改造中精细调控代谢途径仍然十分具有挑战性。
针对此问题，江南大学生物工程学院生物系统与生物加工工程研究室研究人员在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中开发了天然的和合成的NCS文库及NCS的改造方法，以精细调控基因的表达并将其成功应用于N-乙酰神经氨酸（NeuAc）的生物合成途径中。研究人员首先根据转录组学和蛋白质组学数据选择了96种具有潜在的广泛调控强度的内源性NCS，然后使用绿色荧光蛋白（GFP）系统地验证了不同NCS对基因表达的影响。这些NCS可使GFP的表达量呈现出超过4个数量级的差异，并使GFP的表达水平提高至对照的6.95倍。同时，天然的NCS被发现具有不同的动态调控模式，包括：生长偶联型、迟滞表达型、持续表达型和强烈抑制型。在此基础上，研究人员初步探讨了NCS对基因表达影响的因素。首先，以往提出的五种机制，包括N端规则、mRNA二级结构、热力学和动力学、AT含量和带电荷氨基酸残基数被验证发现不能完全适用于B. subtilis中。而通过对已验证的NCS和相应蛋白序列的统计分析发现NCS编码序列中天冬酰胺（N）、赖氨酸（K）、谷氨酸（E）和蛋氨酸（M）四种氨基酸残基的丰度与GFP的表达水平呈正相关（ρ= 0.727，ρs = 0.658，P = 5.031×10 -6），而丝氨酸（S）、色氨酸（W）、甘氨酸（G）、天冬氨酸（D）和半胱氨酸（C）五种氨基酸残基的丰度与GFP的表达水平呈负相关（ρ = - 0.390, ρs = - 0.341,P = 0.014）。同时，基于实验验证，我们重新设计了一系列人工合成的与理性突变的NCS，使GFP的表达量提高至对照的8.47倍。进一步，我们提出了提高或降低蛋白表达水平的NCS突变原则，并开发了网站（http://www.wjiangnan.com/dna/）用以辅助对NCS的设计和应用。
最后，研究人员选择NeuAc的生物合成途径作为实例来测试NCS用于精细调控关键基因表达的有效性。NeuAc又名唾液酸或燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。之前的研究发现枯草芽孢杆菌中NeuAc生物合成的瓶颈之一是GNA1表达不足。因此研究人员使用静态调控的NCS来提高GNA1的表达量，使NeuAc产量从0.8 g/L提高到了2.0 g/L。接下来，研究人员使用NeuAc生物合成途径的动力学模型，将关键酶PfkA和Pyk鉴定为调节靶点，分别使用静态调控和动态调控的NCS组合对其进行表达量的优化。最终，NeuAc的产量提高至对照菌株的3.99倍，在摇瓶上达到2.75 g/L。本研究工作中开发的NCS工具箱可用于调节B. subtilis中的基因表达水平，以精细调控代谢途径和优化基因回路构建。同时，NCS的开发策略可能同样适用于其他重要的工业微生物。
上述研究工作得到了国家重点研发计划（2018YFA090039）、国家自然科学基金（31600068）、江苏省自然科学基金（BK20160176）、中国博士后科学基金会（2016M600363，2017T100327）、国家轻工技术与工程一流学科项目（LITE2018-16）的资助，以“Synthetic N-terminalcoding sequences for fine-tuning gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis”发表在期刊Metabolic Engineering上(doi.org/10.1016/j.ymben.2019.07.001)，2018级博士生田荣臻为第一作者，陈坚教授、刘延峰副研究员为通讯作者。
图5 应用合成和天然的NCS来上调NeuAc生物合成途径中GNA1的表达水平
图6 使用合成和天然NCS进行动力学建模辅助的NeuAc生物合成途径调控
