近日，Biotechnology Notes在线发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队刘龙教授课题组的研究成果“Model-based dynamic engineering of Escherichia coli for N-acetylglucosamine overproduction” (Lu et al., Biotechnology Notes. 2022, 3:15-24)。江南大学2020级博士生卢建功为论文第一作者，李江华教授和刘龙教授为通讯作者。
N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）是人体细胞中一些重要多糖的基本单位，被广泛应用于保健品和化妆品行业。目前，微生物发酵法是生产GlcNAc的主要方法。然而现有的基因工程菌株中均存在较多副产物途径，导致产量及转化率较低，工业化成本高。因此，进一步提高产量及转化率以提高生产经济性是目前微生物发酵法生产GlcNAc急需解决的重要问题。
针对上述问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队基于基因组规模代谢网络模型（GSMM）预测结果，对大肠杆菌不同代谢途径分别进行了阻断、抑制和强化，显著提高了GlcNAc的产量及转化率。首先，在大肠杆菌基因组中构建了GlcNAc合成途径并对关键基因拷贝数进行了优化，GlcNAc产量达到了118.9 g/L。其次，通过在大肠杆菌全基因组规模代谢网络模型iML1515中添加GlcNAc合成反应，并以此反应为目标反应，结合实际发酵过程中的生长曲线和葡萄糖消耗数据，对不同代谢反应的通量进行了分析和优化。根据模型分析和预测的结果，敲除了丙酮酸氧化酶poxB、乳酸脱氢酶ldhA、N-乙酰壁酸-6-磷酸乙醚酶murQ，强化了谷氨酰胺合成酶glnA的表达，发酵液中的乙酸、乳酸及谷氨酸浓度显著降低，GlcNAc产量提高到130.8g/L，对葡萄糖的转化率为44.6%。模拟结果显示磷酸果糖激酶pfkA和磷酸葡萄糖脱氢酶zwf所催化反应的最优通量随发酵过程的进行而不断变化，因此，该研究进一步通过结合转录调控因子pdhR和CRISPRi工具，构建了响应丙酮酸浓度的IPTG诱导型动态调控系统，对pfkA和zwf进行了动态调控。最后，在30-L发酵罐中发酵55小时后，GlcNAc产量提高至143.8 g/L，转化率达到53.9%。该研究的一系列代谢工程策略有助于减少大肠杆菌发酵过程中副产物的产生，提高碳原子经济性，最终实现了GlcNAc的高效合成。
上述研究工作得到了国家自然科学基金（31870069, 32021005）、国家重点研发计划（2020YFA0908300, 2018YFA0900300）、中央高校基本科研专项资金（USRP52019A, JUSRP121010, JUSRP221013）以及山东省重点研发计划项目(2019JZZY011002)等项目的资助。
图1 大肠杆菌中GlcNAc的合成代谢途径
图2 glmS和GNA1拷贝数优化
图3 GSMM的构建与应用
图4 副产物途径的阻断和GlcNAc合成途径的加强
图5 动态调控系统的构建和应用
